Polymerázová reťazová reakcia (PCR). Čo to je, metóda v mikrobiológii, medicíne, kultúre, náteru

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je moderná laboratórna metóda na generovanie veľkého počtu kópií jednotlivých sekcií nukleových kyselín (DNA alebo RNA). PCR sa používa v mnohých oblastiach biológie a medicíny. V lekárskej diagnostike sa táto metóda používa na stanovenie infekčné choroby.

V molekulárnej biológii môže byť účelom kopírovania kus DNA na štúdium funkcie konkrétneho génu alebo iné experimenty (klonovanie génov, zavedenie iných génov, identifikácia mutácií). Pri forenznom vyšetrení sa skúma DNA, aby zodpovedala genetickému materiálu podozrivých na mieste činu.

Čo je analýza?

Pri diagnostike chorôb pomocou metódy PCR sa v biologickom materiáli pacienta izoluje konkrétny úsek DNA infekčného agens.

Ak sa nájde toto miesto, je to priamy dôkaz prítomnosti patogénu v tele pacienta.

PCR môže tiež detegovať zmeny v genetickom materiáli pacienta., ktoré pomáhajú určiť vrodené choroby, zmeny v imunitnom systéme, predispozície k rôznym chorobám.

Pri vykonávaní analýzy PCR je určitá časť molekuly DNA alebo RNA pôvodcu choroby obsiahnutej v biologickom materiáli izolovaná zo vzorky špeciálnymi metódami. Potom sa toto miesto mnohokrát duplikuje pomocou enzýmov.

Syntetizuje sa množstvo DNA, ktoré je možné vizuálne zaznamenať. Skopíruje sa iba určitá časť molekuly DNA.

PCR vyžaduje nasledujúce komponenty:

• Templát DNA (kus DNA, ktorý sa opakovane kopíruje a identifikuje),
• priméry (špeciálne syntetizované jednovláknové krátke molekuly DNA potrebné na naočkovanie syntézy DNA),
• DNA polymeráza (enzým, ktorý katalyzuje reakciu polymerizácie DNA), deoxynukleozid trifosfáty (dusíkaté bázy sú molekuly, ktoré tvoria DNA).
• Ďalšie zložky (ióny horčíka, tlmivý roztok).

Polymerázová reťazová reakcia je metóda, ktorá vyžaduje špeciálne vybavenie (zosilňovač) a pozostáva z nasledujúcich krokov:

• Denaturácia templátovej DNA, pri ktorej sa dvojvláknová DNA štiepi na dve vlákna. Táto fáza trvá 30-40 sekúnd.
• Pripojenie primérov k špecifickým oblastiam DNA nastáva v priebehu 20-60 sekúnd.
• Polymerizácia je syntéza nových reťazcov DNA pomocou enzýmu.

Po opakovanom opakovaní týchto fáz sa syntetizuje požadovaný počet kópií (po 20 cykloch počet kópií dosiahne viac ako milión).

Registrácia vírusovej DNA sa vykonáva po amplifikácii v špeciálnom zariadení (ak je PCR s detekciou v koncový bod) alebo priamo v zosilňovači počas reakcie (ak sa používa PCR v reálnom čase) fluorescenčné metóda.

Kde sa môžem zaregistrovať, koľko to stojí

PCR analýzu je možné vykonať v akomkoľvek lekárskom laboratóriu akreditovanom pre túto analýzu.

Náklady na test závisia od typu infekcie:

Laboratórne	Infekcia / náklady
KDL	DNA cytomegalovírusu - 230 rubľov DNA herpesvírusu typu 6 - 250 rubľov. RNA koronavírus SARS-CoV-2/1600 rubľov.
Hemotest	DNA cytomegalovírusu - 250 rubľov DNA herpesvírusu typu 6 - 240 rubľov. RNA koronavírus SARS-CoV-2-1 700 rubľov.
In vitro	DNA cytomegalovírusu v krvi - 400 rubľov. DNA ľudského herpesvírusu 1 a 2 typov pri škrabaní epiteliálnych buniek kože - 570 rubľov. RNA koronavírus SARS-CoV-2-1990 rubľov.
Citylab	DNA cytomegalovírusu - 240 rubľov DNA ľudského herpesvírusu typu 6 - 290 rubľov. RNA koronavírus SARS-CoV-2-1 800 rubľov.

Odrody PCR

Polymerázová reťazová reakcia je metóda, pre ktorú boli vyvinuté rôzne metódy nastavenia analýzy.

Tieto metódy boli navrhnuté tak, aby znižovali riziko falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov alebo aby vykonávali kvantitatívne alebo kvalitatívnej analýzy, ako aj na stanovenie rôznych nukleových kyselín: DNA (deoxyribonukleová kyselina) alebo RNA (ribonukleová kyselina).

Podľa metódy na stanovenie reakčných produktov sa rozlišujú dva typy PCR:

• PCR v reálnom čase - zosilnenie a detekcia sa vykonávajú súčasne v jednom zariadení. Touto modifikáciou PCR je možné určiť množstvo požadovanej sekvencie DNA v každom cykle syntézy DNA.
• Koncový bod PCR - druh PCR analýzy, pri ktorej sa výsledky zaznamenávajú metódou fluorescencie v špeciálnom zariadení po ukončení polymerázovej reťazovej reakcie.

V laboratórnej praxi existujú rôzne spôsoby nastavenia analýzy, ako napríklad:

• Hot-start PCR. Zvláštnosťou tejto metódy je, že reakcia začína až po dosiahnutí určitej teploty. Reakčné zložky (najmä enzýmy) sú zablokované a začnú pracovať iba pri určitej teplote. Táto metóda zvyšuje presnosť analýzy. Ak sa reakčná zmes zahrieva postupne, existuje riziko tvorby vedľajších produktov reakcie, a preto nepresné výsledky analýzy.
• Na detekciu vírusov s genómom RNAnapríklad vírus hepatitídy C alebo vírus ľudskej imunodeficiencie sa používa metóda nazývaná reverzná transkripčná PCR (RT-PCR). RNA vírusu sa najskôr prevedie na komplementárnu molekulu DNA. Výsledná DNA sa potom použije ako templát pre PCR.
• Multi-primer PCR - spôsob uskutočnenia reakcie, pri ktorom sa súčasne kopíruje niekoľko sekvencií DNA do jednej vzorky. Táto metóda vám umožňuje znížiť spotrebný materiál a znížiť náklady na analýzu.
• Metóda PCR využívajúca technológiu NASBA (Amplifikácia založená na sekvencii nukleových kyselín) je, že RNA vírusu sa používa ako templát na kopírovanie genetického materiálu. Pomocou špeciálnych enzýmov (transkriptáza, RNA polymeráza, RNáza) sa v reakčnom médiu vytvorí komplementárna DNA (cDNA), ako aj komplex molekúl RNA a cDNA. Rozdiel medzi touto modifikáciou a štandardnou PCR je v tom, že ako genetický materiál sa nehromadí DNA, ale RNA. Rozdiel medzi touto metódou a metódou RT-PCR je v tom, že RNA nie je len templát pre syntézu cDNA, ale aj produkt amplifikácie (to znamená konečný produkt reakcie).

Molekuly DNA sú v tele zničené veľmi dlho a môžu byť u pacienta detegované, aj keď antivírusová alebo antibiotická terapia už fungovala. Štandardná metóda PCR preto neumožňuje vyhodnotiť účinnosť terapie.

Na rozdiel od DNA môžu byť molekuly RNA izolované výlučne zo živých buniek alebo vírusov a po zničení živých buniek je molekula RNA tiež rýchlo zničená. Táto úprava vám umožňuje kontrolovať účinok terapie už v čase jej implementácie.

Výhody a nevýhody PCR

V porovnaní s inými laboratórnymi metódami na zisťovanie infekcií má metóda PCR niekoľko výhod:

• Metóda PCR je priama metóda stanovenie genetického materiálu vírusu alebo baktérie vo vzorke. Na rozdiel od iných metód, ktoré určujú nepriame príznaky infekcie, test PCR priamo indikuje prítomnosť vírusu v tele.
• Vysoká špecifickosť metódy, to znamená, že schopnosť identifikovať konkrétny patogén je spojená so skutočnosťou, že je určený genetický materiál, ktorý je pre daný organizmus jedinečný (vírus, baktérie, mikroskopická huba). Špecifickosť tejto metódy sa preto blíži 100%.
• Vysoká citlivosť metódy (tiež blízke 100%) je množstvo vzorky, ktoré možno určiť touto metódou. Stanoví sa dokonca aj malé množstvo molekúl vírusu alebo baktérie v biologickom materiáli. To umožňuje identifikovať nosič vírusu ešte pred nástupom symptómov.
• Metóda je univerzálna na detekciu DNA / RNA akýchkoľvek vírusov alebo baktérie. Pomocou PCR je možné určiť akékoľvek infekcie, ako aj chronické ochorenia.
• Metóda rýchlej analýzy, trvanie je asi 4-6 hodín.

Nedostatky:

• Polymerázová reťazová reakcia je metóda na priamu detekciu genetického materiálu (DNA) patogénu a neumožňuje vyhodnotiť účinnosť terapie, pretože molekula DNA nie je dlho zničená, aj keď terapia už je pracoval.
• Nevýhodou môže byť vysoká citlivosť metódy. Napríklad po ukončení terapie PCR stále detekuje DNA mŕtvych buniek u zdravého pacienta, čím sa získa falošne pozitívny výsledok.
• Rôzni výrobcovia testov PCR môžu detegovať rovnaké infekcie pomocou rôznych systémov. Preto sa výsledky stanovenia rovnakej infekcie v laboratóriách môžu líšiť. Dynamické kvantitatívne testy sa odporúčajú vykonávať v rovnakom laboratóriu.
• Niektoré testy, najmä genetické, môžu byť dosť drahé.
• Na vykonávanie testov PCR je potrebné drahé vybavenie, činidlá a dobre vyškolený kvalifikovaný personál. Presnosť výsledkov analýzy závisí od kvality činidiel a spôsobu odberu biologických vzoriek.

Na identifikáciu infekcií je vhodná PCR (rozsah aplikácie metódy v medicíne)

Používa sa metóda PCR na identifikáciu, tj. kvalitatívne stanovenie, ako aj na kvantitatívne stanovenie DNA a RNA patogénov rôznych infekcií:

• vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV);
• vírusy hepatitídy A, B, C, D, G;
• patogény, ktoré spôsobujú choroby urogenitálneho traktu, napríklad Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogény, ktoré spôsobujú dysbiózu urogenitálneho traktu a kandidózu, napríklad mikroorganizmy, ako napríklad Saccharimonas aalborgensis, mikroskopické huby rodu Candida;
• pôvodcovia infekcií ľudským papilomavírusom;
• TORCH a Herpesvirus infekcie;
• patogény prírodných ohniskových infekcií, ktoré môžu šíriť vtáky, zvieratá, hmyz sajúci krv, napríklad borelióza, encefalitída, západonílska horúčka;
• gastrointestinálne infekcie;
• pôvodcovia tuberkulózy;
• respiračné infekcie (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• nozokomiálne infekcie (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Vírusová záťaž je tiež určená metódou PCR, skúma sa dynamika ochorenia a účinok terapie.

Polymerázová reťazová reakcia v medicíne má ďalšie dôležité uplatnenie - je to stanovenie polymorfizmov ľudských génov (lokálne zmeny) a mutácií. Drobné lokálne zmeny v sekvencii DNA rôznych génov sú príčinou vzniku rôznych chorôb.

Tieto choroby môžu byť dedičné. Metóda PCR vám umožňuje identifikovať tieto mutácie a zabrániť vzniku alebo zmierniť priebeh chorôb.

PCR sa používa na detekciu mutácií, ktoré spôsobujú vývoj chorôb, ako sú:

• porušenie zrážania krvi;
• srdcovo-cievne ochorenia;
• metabolické poruchy (napríklad intolerancia laktózy);
• zhoršená reprodukčná funkcia (mutácie, ktoré spôsobujú mužskú neplodnosť);
• rakovina prsníka a vaječníkov;
• autoimunitné choroby.

Ukážky pre výskum

V závislosti od typu zistenej infekcie môžu byť vzorkami na analýzu vzorky biologických tekutín, tkanív, epiteliálnych buniek:

• krvné sérum / plazma, periférna, pupočníková krv;
• vzorky epitelu sliznice (krčka maternice, vagíny, močovej trubice);
• škrabance spojovky, nosnej dutiny, orofaryngu;
• sperma, sekrécia prostaty;
• škrabanie z erozívnych a ulceratívnych lézií;
• moč;
• spútum;
• výkaly;
• iné biologické tekutiny (plodová voda, mozgovomiechový mok, plodová voda, kĺbová tekutina);
• bioptický materiál pľúc, pečene, gastrointestinálneho traktu;
• bronchoalveolárny výplach.

Pravidlá dodávania biologických tekutín pre PCR

Polymerázová reťazová reakcia je metóda, ktorá vyžaduje striktné dodržiavanie odporúčaní aj vo fáze zberu biologického materiálu.

Nedostatočný odber vzoriek môže viesť k falošne pozitívnym alebo falošne negatívnym výsledkom.

• Ak je na prepravu a skladovanie biologického materiálu pred analýzou potrebné špeciálne transportné médium, odporúča sa použiť transportný roztok vyrobený tou istou spoločnosťou, ktorá dodáva súpravy PCR test.
• Odber vzoriek na test PCR sa vykonáva oddelene od vzoriek určených na iné štúdie. Na výber sa používajú jednorazové sterilné nástroje, nádoby a rukavice.
• Odporúča sa odobrať vzorky na analýzu pred začiatkom terapie a 2 týždne po jej ukončení.
• Krv sa odporúča darovať ráno na prázdny žalúdok. Celá krv je uložená v antikoagulačných skúmavkách (EDTA, sodná soľ kyseliny citrónovej). Iné antikoagulanciá, ako napríklad heparín, nie sú povolené, pretože inhibujú reakciu PCR. Sérum je skladované bez antikoagulancií.
• Pri zbere moču je potrebné zozbierať ranný moč (prvá porcia), asi 30-40 ml. Vzorku je možné uchovávať, kým nie je odoslaná do laboratória, nie dlhšie ako 2 hodiny.
• Pred zberom slín vypláchnite ústa fyziologickým roztokom. Pred odberom vzorky sa odporúča 4 hodiny nejesť. Množstvo vzorky je od 3 do 5 ml. Sliny sa odoberajú bezprostredne pred analýzou; materiál sa môže skladovať zmrazený pri mínus 20 ° C.
• Na odber vzoriek spúta sa používajú jednorazové skúmavky. Požadovaný objem vzorky je od 5 do 10 ml. Pred analýzou možno vzorku skladovať 24 hodín pri 4 ° C.
• Synoviálna tekutina sa odoberá injekčnou striekačkou. Na zber a skladovanie materiálu sa odporúča používať jednorazové sterilné vybavenie. Požadovaný objem vzorky je 1 ml.
• Na odobratie vzorky epitelu slizníc sa používajú sondy (napríklad z viskózy) alebo cytobrushes.

Ako sa pripraviť na analýzu PCR

Na získanie správnych výsledkov testov je potrebný správny zber materiálu, preto sa odporúča dodržiavať nasledujúce pravidlá:

• Počas akútneho priebehu infekcie sa odporúča zbierať biologický materiál, ale v súčasnej dobe by sa nemali užívať antibakteriálne látky.
• Pred odobratím vzoriek z pošvy sa odporúča prestať užívať akékoľvek vaginálne lieky a tiež nevykonávať postupy, ako je sprchovanie, po dobu 24 hodín.
• Pred odobratím vzorky z močovej trubice by ste sa mali zdržať močenia 1,5-2 hodiny, ošetriť vonkajší vstup močovej trubice fyziologickým roztokom.
• Odporúča sa odobrať vzorky moču ráno.
• Pred zberom slín by ste mali jedlo, lieky a alkohol prestať používať 12 hodín pred odberom vzoriek. Pred odobratím vzorky sa ústna dutina a zuby vyčistia zubnou kefkou bez pasty, ústnu dutinu je potrebné dôkladne opláchnuť vodou bez použitia ďalších prostriedkov. Sliny sa odoberajú injekčnou striekačkou.
• Pri odbere škrabancov z orofaryngu nejedzte ani nepite vodu 2 hodiny. Neodporúča sa používať spreje na hrdlo, žuvačky, pastilky alebo si čistiť zuby.
• Pri zbere spúta sa odporúča dôkladne spracovať ústnu dutinu: vyčistite si zuby, opláchnite ústa. Zozbierajte ranný hlien alebo hnisavý výboj. Na testovanie stačia 3 ml vzorky. Na zvýšenie objemu sekrétov môžete užívať expektoračné inhalácie alebo lieky.
• Na vnútornú stranu dolného viečka sa odoberie náter zo spojivky oka, pričom sa nedotýkajte rias.

Postup výteru (pre ženy a mužov)

Pri skúmaní urogenitálneho traktu u žien sa vykonáva škrabanie pošvovej sliznice, močovej trubice a krčka maternice. Vzorky sa odoberajú pred ručnou kontrolou. Odber vzoriek sa vykonáva pomocou sterilných sond s tampónom alebo cytobrushom.

Pred zákrokom sa vonkajšia oblasť močovej trubice ošetrí sterilným roztokom, prebytočný hlien sa odstráni z pošvy a krčka maternice. Sonda sa vloží do močovej trubice alebo do krčka maternice do hĺbky 0,5-1,5 cm. Materiál sa zbiera jemnými rotačnými pohybmi.

Zo zadnej časti vagíny sa odoberie tampón. Pri vyberaní sondy sa neodporúča dotýkať sa stien pošvy.

Sonda (jej pracovná oblasť) sa premyje v skúmavke transportnou kvapalinou, ktorú dodáva výrobca súpravy na diagnostiku PCR, a pritlačí sa k stenám skúmavky. Niekedy výrobca sady odporúča rozbiť sondu a nechať pracovnú časť priamo v skúmavke. Tým sa zníži strata vzorky.

Po kolposkopii sa neodporúča odoberať stery na PCR. Pred užitím materiálu sa odporúča prestať užívať vaginálne tablety a lieky do 2-3 dní. Náter sa odoberie najskôr 2-3 dni po ukončení menštruačného toku.

Pri odoberaní náteru od mužov sa vonkajšia oblasť močovej trubice ošetrí sterilným roztokom a odstránia sa prebytočné sekréty. Na odber vzorky sa vloží sterilná sonda 3-4 cm. Pracovná časť sondy sa premyje v skúmavke transportným roztokom.

Ako sa dešifrujú testy PCR

Vo výsledkoch testu PCR je uvedený okrem názvu analýzy a výsledkov testu normou alebo referenčnými hodnotami, s ktorými je možné porovnať získaný výsledok:

Názov analýzy	Výsledok	Norm
DNA Chlamidia trachomatis	Pozitívne	Negatívne
Micoplasma hominis DNA	Negatívne	Negatívne

Pozitívny výsledok znamená prítomnosť DNA patogénu v biologickom materiáli, negatívny výsledok znamená jeho absenciu.

Pri hodnotení vírusovej záťaže sa kvantifikuje DNA. V tomto prípade tabuľka výsledkov obsahuje číselnú hodnotu počtu kópií detegovanej DNA, napríklad:

Register	Výsledok	Referenčné hodnoty
Kvantifikácia DNA vírusu hepatitídy B	4,3 * 10v 3 st.	<300 klinicky nevýznamných; > 300 pozitívnych

V prípade kvalitatívnej a kvantitatívnej analýzy hodnotí výsledky ošetrujúci lekár.

Pri analýze získaných výsledkov sa často vyskytujú tieto chyby:

• Včasný kontrolný test PCR po ukončení kurzu antibiotík (po 1-2 týždňoch). DNA infekčného agens zostáva v tele pacienta niekoľko týždňov potom, čo sú bunky infekčného agens zničené terapiou. Preto je získaný pozitívny výsledok falošne pozitívny a záver, že terapia nefungovala, je mylný. Ak hovoríme o príčinných činiteľoch infekcie na kožnom epiteli, potom sa test odporúča vykonať najskôr mesiac po ukončení liečby.
• Pri interpretácii analýzy PCR niektorých infekciínapríklad infekcia cytomegalovírusom, pozitívny výsledok neznamená vždy priebeh infekčného procesu a potrebu terapie. Len v 60% prípadov s pozitívnym výsledkom PCR sa u pacientov vyvinú klinické príznaky ochorenia.
• Pri interpretácii testov PCR na ľudský papilomavírus pozitívny test možno mylne interpretovať ako príčinu vývoja onkologických procesov, aj keď u 90% pacientov infekcia HPV ustúpi za 6-24 mesiacov. Ak je výsledok pozitívny, je potrebné vykonať štúdiu epitelu krčka maternice a až potom vyhodnotiť riziko rakoviny.
• V štúdiách infekcií urogenitálneho traktu u žien sa odporúča nielen určiť oportúnne infekcie, ale aj porovnať ich počet s počtom Lactovacillus, ktoré sú považované za hlavných predstaviteľov normálnej mikroflóry vagíny. Takáto analýza vám umožňuje určiť dysbiózu, správne interpretovať výsledky testu PCR a predpísať terapiu.

Polymerázová reťazová reakcia je metóda používaná na kvantifikáciu vírusovej a bakteriálnej záťaže. Je potrebné mať na pamäti, že pre niektoré infekcie neexistuje jasná regulácia, ktorá vám umožňuje určiť klinický význam získaných výsledkov.

To znamená, že interpretácia výsledkov je subjektívna a môže byť chybná. Takže napríklad oportunistické Ureaplasma, Mikoplazma, Gardnerella pri absencii sťažností a klinických príznakov zápalu nevyžadujú terapiu. Neprimerané predpisovanie terapie vedie k nárastu prípadov dysbiózy a vaginózy.

Video o analýze PCR

Diagnostika vírusovej infekcie pomocou PCR: vysvetlenie metódy: